• 细胞培养常见问题及解答
  • 点击数:  发表日期:2008-9-2
    1. 如何选用特殊细胞系培养基?
      培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养最好首选AIM V(12005)培养基(SFM)。
    2. L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?
      L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。
    3. GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?
      GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。
      GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。
    4. 什么培养基中可以省去加酚红?
      酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。
      酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。
    5. 如何用台盼兰计数活细胞?
      用无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000个/毫升,在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。
    6. 如何消除组织培养的污染?
      当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。
      高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

      1. 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。
      2. 分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
      3. 每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。
      4. 确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。
      5. 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
      6. 重复步骤4。
      7. 在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。
    7. 培养基中丙酮酸钠的作用是什么?
      丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。
    8. Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?
      HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。
    9. 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?
      二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。
      我试用SF900 II时,细胞生长良好,但是我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好。
      如果目的蛋白是一个后期蛋白,它将与蛋白酶一起表达,这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中,这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白,从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题,加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%),让血清给蛋白酶提供作用底物。
    10. 20°C下配制的缓冲液,在较高或较低的温度下PH值会改变吗?
      对于普通使用的缓冲液,PH值随温度变化而变化。
      下表列出温度改变10℃时,PH值的变化情况:
      例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-(2x0.310)=6.78
      缓冲系统 pKa/20℃ [ Delta]pKa/10℃

      Mes 6.15 -0.110
      Ada 6.60 -0.110
      Pipes 6.80 -0.085
      Aces 6.90 -0.200
      Bes 7.15 -0.160
      Mops 7.20 -0.013
      Tes 7.50 -0.200
      Hepes 7.55 -0.140
      Tricine 8.15 -0.210
      Tris 8.30 -0.310
      Bicine 8.35 -0.180
      Glycylglycine 8.40 -0.280
    11. 室温下(25)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用时PH值是多少?
      缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃时,不同的PH值。

      4°C 25°C 37°C
      8.1 7.5 7.2
      8.2 7.6 7.3
      8.3 7.7 7.4
      8.4 7.8 7.5
      8.5 7.9 7.6
      8.6 8.0 7.7
      8.7 8.1 7.8
      8.8 8.2 7.9
      8.9 8.3 8.0
      9.0 8.4 8.1
      9.1 8.5 8.2
      9.2 8.6 8.3
      9.3 8.7 8.4
      9.4 8.8 8.5
    12. 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少?
      生长培养基的PH值对细胞的增殖和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系,在PH值 6.0~6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时,培养基的最适渗透压是345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式,减少技术问题,保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。
    13. High Five细胞有任何其它名称吗?
      High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
    14. PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别
      PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用,PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是杂交瘤生产培养基,也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。
    15. 在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少?
      High Five无血清培养基中去污剂的浓度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。
    16. High Five细胞用多大的密度冻存?
      3.0x10E6 cells/ml。
    17. 在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀,加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗?
      可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解,对实验不会有不利的影响。
    18. 如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗?
      强力推荐使用脱落细胞的方法,因为这项技术破坏性最小,生活力最高。正如手册上所显示,通过使用巴斯德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。
      胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞:
      1. 去除培养基。
      2. 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS。
      3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。
      4. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
      5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液,移入锥形管,用2ml培养液洗瓶壁,移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性
      6. 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。
      7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
    19. 在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少?
      为了防止悬浮培养细胞聚集的形成,使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
    20. 在重新冻存sf9细胞前,它可以传多少代?随着传代的次数的增加,它的感染能力会降低吗?
      通常情况当细胞经过30次传代后,应该返回冻存。无论什么时候计数时,都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍,细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降,它们的感染力将不在是有效的。