• 常见组织细胞的培养方法
  • 点击数:  发表日期:2008-1-2
  • 体内组织细胞在体外培养时,所需培养环境基本相似,但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同,各自要求条件有一定差别,所采取的培养技术措施亦不尽相同,现介绍个别组织细胞培养的要点如下:

    第一节 上皮细胞培养

    上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮组织,故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞,培养时生长速度往往超过上皮细胞,并难以纯化,同时上皮细胞难以在体外长期生存,因此纯化和延长生存时间是培养关键。

    体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜,因此培养在有胶原的底物上可能利于生长,另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层(用射线照射后)时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度,向培养基中加入表皮生长因子,均有利于表皮细胞生长。

    以表皮细胞为例,用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞,其法如下(黑木凳志夫 1981)

    1、取材:外科植皮或手术残余皮肤小块,早产流产儿皮肤更好,取角化层薄者,切成0.5-1平方厘米小块。

    2、置0.02%EDTA中,室温,5分钟。

    3、换入0.25%胰蛋白酶中,4℃过夜。

    4、分离:取出皮块,用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。

    5、取出表皮,剪成更小的块后,置0.25%胰酶中,37℃,30—60分钟。

    6、反复吹打,制成悬液。

    7、培养:用80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸去上清。

    8、直接加入培养基(Eagle加20%小牛血清)制成细胞悬液,接种入培养瓶,CO2温箱培养。


    第二节 内皮细胞培养

    内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞,对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子(TAF)等有很大价值。

    研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便,其法如下:

    1、产后新鲜脐带,无菌剪取10—15厘米长一段,如不能立即培养,可于12小时内保存于4℃。

    2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血,在入口处用线绳扎紧,以防液体返流。

    3、用血管钳夹紧脐带一端,从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶,充满血管,消化3—10分钟;注入口用线绳扎,以防液体返流。

    4、吸出含有内皮细胞的消化液,于离心管中,注入温PBS轻轻反复冲洗后,一并注入离心管中(此步骤可重复)。
    5、离心去上清,加入RPMI1640培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。


    第三节 神经细胞培养

    神经细胞(神经元)不易培养,只有在适宜情况下,如接种在胶原底层上,或加入神经生长因子和胶质细胞因子时,可出现一定程度的分化,长出突起等现象,但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。

    人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养,不仅能获得生长的胶质细胞,也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来,胶质细胞在培养中生长不稳定,不易自发转化,但对外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。

    一. 设备: 无菌操作设备。

    二. 大型设备CO2培养箱:恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。

    倒置显微镜:用于每天观察贴壁细胞生长情况。

    解剖显微镜,用于准确地取材。

    常温冰箱:-4℃,用于保存各种培养液,解剖液和鼠尾胶。

    低温冰箱:-20℃--80℃,用于储存血清酶,贵重物品和试剂。

    电热干烤箱:用于消毒玻璃器皿。

    高压消毒锅:用于消毒培养皿,手术器械。

    过滤器:配制解剖液、培养液,必须过滤后才可使用,以去除细菌。

    渗透压仪,pH剂,天平等。

    三. 培养器皿及手术器械

    1 培养皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直径。

    2 培养板,24-40孔,可用于开放培养。

    3 培养瓶:

    4 吸管,常用1,5,10ml,均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

    5 各类培养液贮存器。

    6 小型手术器械。

    准备:

    一 配制培养液

    (1) 解剖液:以无机盐(去除Ca2+, Mg2+)加葡萄糖配制成PBS缓冲液,保持一定的渗透压和pH值。

    (2) 基础培养基(MEM):主要为多种氨基酸,加入葡萄糖,双蒸馏水溶解。

    (3) 接种培养液:用于胰酶消化后的细胞分散,做成细胞悬液,其成分为MEM含1%谷氨酰胺,另加入10%马血清,当天配制。

    (4) 维持培养液:接种后24h,全部换成此液,后每2周换一次,每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清,1%谷氨酰胺,及适量的支持性营养物质。

    二 培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶,多聚赖氨酸,再涂胶

    三消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d,达两次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包装,置于烤箱中干燥消毒,于培养前1天进行。

    神经细胞分散培养

    (一) 选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜,小鼠以18d为宜,大鼠纹状体以10d为宜;若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚,则黑质以13d,纹状体18-21d为宜;小脑以20-21d小鼠胚胎,所获蒲氏细胞成活率高,颗粒细胞正在分化;脊髓与DRG联合培养,常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神经成活率高。

    (二) 取材。脑则取出相应组织,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上,用小刀将其要成背腹两侧,分别培养。

    (三) 细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接种液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用细口吸管吹打细胞悬液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上层细胞悬液,计数,预置细胞密度,接种于培养皿(1×106),做电生理应为5×105或更低。

    (四) 抑制胶质细胞生长。培养3-5d后,也有人认为培养7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。

    (五) 观察。接种6-12h,开始贴壁,并有集合现象,细胞生长突起明显,5-7d胶质细胞增生明显,7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面,形成地毯,2周时神经细胞生长最丰满,四周晕光明显,一个月后,有些神经细胞开始退化,变形,甚至出现空泡,一般培养2-4周最宜。

    但神经细胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能传代,不会有细胞周期,而且随培养时间的延长,细胞数量在下降,但胶质细胞可以,神经胶质细胞也可以。在培养过程中,早期9-12d时,有较多的神经细胞死亡,这是第一次死亡阶段,应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多,且相互形成突触。

    (六) 常用培养细胞实验有:FCM的蛋白总量分析;膜片钳与离子通道的分析;免疫组化分析;

    但免疫组化分析应注意,由于抗体直接作用于活细胞,不易穿透活细胞,故对核内抗原定位时,首先考虑膜对抗体的通透性问题。常用化学试剂以增加其通透性或采用冰冻方法解决。

    在免疫组化中,或其它组织学染色中,常用不同的染色方法以区分不同细胞,如半乳糖脑苷脂对小树突胶质细胞标记明显;GFAP对星形胶质细胞具有特异性染色等。这对研究神经系统中胶质细胞功能具有极大的应用价值。神经胶质细胞以往多被忽视,其在脑血管疾病(如缺血性损伤)、退行性疾病(如AD、PD)、损伤后胶质细胞的填充等具有不可忽视的作用。它也是神经细胞功能和营养支持的物质基础。


    第四节 肌组织细胞培养

    各种肌组织均可用于培养,以心肌和骨骼肌较实用。

    (-)骨骼肌细胞培养

    1、出生1一2天的乳鼠,引颈处死。

    2、无菌取大腿肌组织,切成0.3一0.5cm2小块后,用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,无菌纱网或纱布滤过。

    3、计数调整细胞密度。

    4、快接种量2×106/皿入培养基培养。

    5、培养基内含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促进分化。

    接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化,明胶配置:用Hanks液配成0.01%明胶。
    该细胞接种率约50%,细胞生长开始呈纺锤形,培养50-52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止,此时可观察到横纹,一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。

    (二)心肌细胞培养

    心肌细胞是最早的培养材料,Carrel曾长期培养过心肌组织,至今心肌仍不失为好的培养物,最常用的是鸡胚心肌。

    心肌比较容易培养和生长,可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法,均可获良好的效果。取心室肌培养较好,原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形,培养成功时,一周后可见节律性收缩现象。


    第五节 巨噬细胞培养

    巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周,多用做原代培养,难以长期生存。

    巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均获恶性,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。

    培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,以小鼠腹腔取材法最为实用,其法如下:

    1、实验前三天,向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml(勿注入肠内!),以刺流产生大量的巨噬细胞。

    2、引颈处死小鼠。

    3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3-5秒。

    4、置动物于解剖台,用针头固定四肢,持镊撕开腹部皮肤,但勿伤及腹膜壁,把皮肤拉向上下两侧,暴露出腹膜壁。

    5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同时用手指从两侧压揉腹膜壁,使液体在腹腔内流动。

    6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧.使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

    7、小心拔出针头,把液体注入离心管。

    8、4℃下250g离心10分钟后,去上清,加10ml Eagle培养基。

    9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞,其中90%为巨噬细胞。

    10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。

    11、接种数小时后,除去培养液,可去除其它白细胞,纯化培养细胞,用Eagle液冲洗1一2次,再加新Eagle培养液置CO2温箱中。


    第六节 肾小球分离、移植培养

    SD大鼠颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡1~2分钟,2次,置超净台内,打开腹腔取出肾脏剪碎,置含Hank's液的无菌培养皿洗涤,置80目不锈钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网,滤过组织Hank's液混合物用吸管吸至120目不锈钢筛网,滤过,去小组织块,滤过物吸至200目不锈钢筛网,轻轻滤过,Hank's液洗涤1次,收集网上肾小球,镜下观察为分离良好的肾小球。

    肾小球用0.2%胰酶、0.1%胶原酶,37℃消化20分钟,加血清终止胰酶反应,离心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至24孔培养板或25ml培养瓶,使肾小球大于60个/cm2,加培养基5~10ml(培养基组成:F12—3T3上清1:1;5%马血清;2.5%胎牛血清;胰岛素5μg/ml;25ng/ml氢化可的松;5μg/ml转铁蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲状腺素0.02ng/ml;D-缬氨酸150ng/ml)肾小球培养8~10天,去除肾小球未生长组分,细胞继续培养24小时,形态学观察:细胞生长成单层多角型细胞,直径约100μm。


    第七节 裸小鼠移植瘤单细胞分离培养

    无菌条件下取出小鼠移植瘤组织,剪成1mm3小块,用0.5%胶原酶室温消化30分钟到1小时,再加等体积0.2%胰酶消化5~8分钟,在消化过程中用吸管吹打组织块或用自制装置(分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成,滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞)来回推动注射器吹打组织以分离单细胞,终止酶消化方法同上。

    常规方法接种培养收获细胞。