• 凝胶电泳实验操作
  • 点击数:  发表日期:2008-1-2
  • 凝胶电泳实验操作



    琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, E 染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng 的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA 条带,用于以后的克隆操作。

    琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA 片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp 至近50kb 的DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp 的DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA 电泳。

    琼脂糖主要在DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,

    在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

    1、 DNA 的分子大小:

    线状双链DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA 分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。

    2、 琼脂糖浓度

    一个给定大小的线状DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA 分子的大小。分离小于0.5kb 的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb 的DNA 分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

    3、 DNA 分子的构象

    当DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA 移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA 带难以确定是质粒DNA 不同构象引起还是因为含有其他DNA 引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA 带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA 图谱,则为同一种DNA。

    4、 电源电压

    在低电压时,线状DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

    5、嵌入染料的存在

    荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA 迁移率降低15%。

    6、 离子强度影响

    电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA 几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA 变性。

    对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。





    琼脂糖凝胶的制备

    1、 取5×TBE 缓冲液20ml 加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。

    2、 胶液的制备:称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

    3、 胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。

    向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(E 溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB 加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml 的EB 溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

    4、 加样:取10μl 酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA 含

    量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip 头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

    5、 电泳:加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA 以上。

    当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时,停止电泳。

    6、 染色:未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中,室温下染色20-25 分钟。

    7、 观察和拍照:在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB 的电泳胶板。

    DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上,采用全色胶片,光圈5.6,曝光时间10-120 秒(根据荧光条带的深浅选择)。