• 细胞培养的基本方法-细胞分离技术
  • 点击数:  发表日期:2008-1-2
  • 细胞分离技术

    一、从原代组织中分离细胞 将组织块分离(散)成细胞悬液的方法有多种,最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。

    从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短,以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织,获得较高产量的有活性细胞。

    1.胰蛋白酶 (Trypsin)
    ●在去除不需要的组织后,使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm小片,通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀,去除上清液。重复清洗2到3次。
    ●将盛有组织碎片的容器置于冰上,去除残留的上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶(100mg组织加入1ml 胰蛋白酶)。
    ●在4℃孵育6到18小时,使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
    ●移弃组织碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
    ●在组织碎片加入热的完全培养基,用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基,要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
    ●通过无菌不锈钢丝网(100~200mm)过滤,分散所有剩余组织。计数和接种细胞,进行培养。

    2.胶原酶 (Collagenase)
    ●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗组织碎片几次。
    ●加入胶原酶(50~200单位/ml,溶解在HBSS中)。
    ●在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。
    ●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的胶原酶。
    ●通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
    ●再一次在培养基中悬浮细胞,计数和接种细胞,进行培养。

    3.Dispase
    ●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片,用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
    ●加入Dispase(0.6~2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液)
    ●在37℃孵育20分钟到几个小时。
    ●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的Dispase。
    ●通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。
    ●再一次在培养基中悬浮细胞,计数和接种细胞,进行培养。

    二、从原培养容器中分离细胞:以下是从基层迅速分离细胞,且保持细胞完整性的一般步骤。这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用,每一种系统****条件和施用浓度应该根据经验加以确定。
    ●再次培养时检测细胞的活性。
    ●细胞的活率应该超过90%
    ●对于无血清培养基,降低胰蛋白酶使用量。

    1. 移弃使用过的细胞培养基。

    2. 使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸.)清洗细胞(看表确定正确的清洗溶液)。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液,通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层,然后去除清洗液。

    3. 以2~3ml/25cm2的量,加选择的分离液(见表)到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃孵育培养瓶,轻轻摇动培养瓶。通常,在5到15分钟内,细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程,避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系,可以轻轻敲打,以加速分离过程。

    4. 当细胞完全分离时,垂直放置培养瓶,让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基,通过移液管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。

    5. 对于无血清培养基,加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用1∶1(v∶v)0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。

    第三节 细胞的冻存与复苏

    为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑,考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异,有时因寄赠、交换和购买,培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室,****的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(-70℃~-196℃)的特点。细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时,细胞内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。细胞低温保存的关键,在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内,水晶呈针状,极易招致细胞的严重损伤。

    一、细胞的冻存:为避免污染造成的损失,最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化,需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前,细胞应该特性化并检查是否污染。

    有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基,成分可能如下:
    ◆包含10%甘油的完全培养基,
    ◆包含10%二甲基亚砜(DMSO)的完全培养基,
    ◆50% 细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基,或
    ◆50% 细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。
    对于无血清培养基,一些普通的培养基成分可能是:
    ◆50% 细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基,或
    ◆包含有7.5%二甲基亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。

    1.悬浮细胞
    ●计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200~400g离心5分钟沉淀细胞,使用移液管移去上清到最小体积,不要搅乱细胞。
    ●以1×107到5×107细胞/ml密度,在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞,或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中,再次悬浮细胞。
    ●分装进冻存管,将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中,5分钟内开始冷冻步骤。
    ●细胞以1℃/分钟进行冷冻,可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后转移到液氮中贮存。

    2.贴壁细胞
    ●使用分离试剂从基层分离细胞,分离时尽可能温和,使对细胞的损伤减少到最小。
    ●在完全生长培养基中,再次悬浮分离细胞,确定有活力细胞数。
    ●以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积,不要搅乱细胞。
    ●以5×106到1×106细胞/ml密度,在冻存液中悬浮细胞。
    ●分装进冻存管,将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中,5分钟内开始冷冻步骤。
    ●细胞以1℃/分钟进行冷冻,可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后转移到液氮中贮存。

    二、冻存细胞的复苏:冻存细胞较脆弱,要轻柔操作。冻存细胞要快速融化,并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂(DMSO或甘油)敏感,离心去除冻存培养基,然后加入完全生长培养基中。

    1.直接铺板方法
    ●取出贮存细胞,37℃水浴中快速融化。
    ●直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数,细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。
    ●培养细胞12到24小时,更换新鲜的完全生长培养基,去除冻存剂。
    2.离心方法
    ●取出贮存细胞,37℃水浴中快速融化。
    ●把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基,轻轻混匀。
    ●以大约80x g离心2到3分钟。
    ●弃去上清。
    ●在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞,并且进行活细胞计数。
    ●细胞铺板,细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。

    三、细胞的分化、衰老与死亡

    1.细胞的分化:一个成年人全身细胞总数约1012个,可以区分为200多种不同类型的细胞:形态结构,代谢,行为,功能等各不相同。追根溯源,这么多种细胞均来自一个受精卵细胞。所以,通常把发育过程中,细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。细胞分化发生在胚胎阶段,也发生在胎儿出生以后,乃至成人阶段。例如,人体血细胞的产生和分化,这个过程在人的一生中一直持续着。

    由旺盛生长不断分裂的细胞,转入分化,通常从细胞周期中G1期开始时一个确定的点G0点“逃逸”出细胞周期。旺盛生长分裂的细胞和各种分化了的细胞,它们的基因表达和代谢活动各不相同。

    2.细胞的衰老:体外细胞培养实验证明:

    成纤维细胞:来自胎儿传代50次后衰老死亡,来自成人传代20次后衰老死亡(与具体年龄有关);来自小鼠传代14--28次后衰老死亡,来自乌龟传代90--125次后衰老死亡。

    细胞衰老过程中会发生一系列的变化,包括:蛋白质合成速度降低,已有蛋白质结构变化,特异蛋白质成份出现;同时,细胞核,线粒体,膜系统、骨架系统等都有结构、功能的改变。

    细胞衰老原因,尚无定论,出现过好几种理论与假说,其中得到较广泛认可的是“自由基损伤假说”。

    3.细胞凋亡:细胞的死亡是个体存活的正常现象,常见的细胞死亡形式有3种:坏死、凋亡和细胞毒性。多细胞生物的生命活动中,因为环境因素的突然变化或病原物的入侵,导致一部分细胞死去,称为细胞的病理死亡,或细胞坏死。坏死是细胞暴露于严重的物理或化学刺激时导致的细胞死亡;细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件,不依赖于其它两种细胞死亡机理,如杀伤T细胞的细胞毒性作用。

    还有一种情况,一部分细胞的死亡是生物个体正常生命活动(代谢、生长、发育、分化)的一个必要部分;似乎带有“牺牲局部,保全整体”的意味。这种情况下的细胞死亡,明显地受遗传控制,称为细胞凋亡。 凋亡(Apoptosis)则是程序性的、正常的细胞死亡,是机体清除无用的或者不想要的细胞的手段。它与细胞坏死是两个截然不同的过程,无论从形态学、生物学还是生化的特征来说,都有明显的区别。细胞凋亡现象普遍存在于生物界。细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用,在多细胞动物的发育、形态建成与维持中扮演至关重要的角色。作为细胞的一种基本生命现象,凋亡失控的结果将是可怕的:凋亡不足时,易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病;而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征(HIV)、重症肝炎与退行性神经疾病,如老年性痴呆症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)。因此研究细胞凋亡及其机理具有重要的理论和实践意义。

    细胞凋亡与坏死的区别

    坏死

    形态学特征-膜完整性丧失,胞浆和线粒体膨胀 ,全细胞裂解

    生化特征-离子内环境失调,非能量依赖性的(被动过程,在4°C也可以发生),随机消化DNA(电泳显示为DNA弥散状态),Postlytic DNA断裂

    生理学特征-影响群组细胞 由非生理学因素引起(如补体攻击、代谢中毒、缺氧等),被巨噬细胞吞噬, 周围有明显的炎症反应

    凋亡

    形态学特征-胞膜出芽,但保持完整,染色体聚集在核膜周边,胞浆收缩、细胞核凝集,最后细胞分裂为凋亡小体,Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加

    生化特征--ATP依赖性的(主动过程,在4°C不能发生),以核小体为单位剪切DNA(电泳显示为DNA ladder),Prelytic DNA 断裂,线粒体释放多种因子至胞浆中(细胞色素c、AIF),Caspases级联活化,膜对称性改变(PS外翻)

    生理学特征--只影响单个细胞 ,由生理学刺激诱导(如生长因子缺乏、激素环境改变等),被临近细胞和巨噬细胞吞噬 无炎症反应