• 小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养
  • 点击数:  发表日期:2007-12-29
  • 1.取小鼠股骨胫骨,小鼠要年轻!(6W-8W,以前用只年把的养出来外形也张牙舞爪,但流式检测没有CD11c表达,很奇怪啊;性别方面公母不限,经典版本说公的好,公的壮实,骨头大)
    2.冲骨髓细胞,我冲出来的骨髓细胞永远没有文献上说的那样多,但不影响大局,我一次用两只,怕出意外少了细胞,论坛里有战友说不要混一起,我不知道具体原因,盼赐教
    3. 细胞计数,不去红细胞!(不知是好是坏,文献说去红细胞会把一些祖细胞也去掉了)记数,计数只记白细胞(形态学区分,红细胞无核较小,目前我的眼睛目前还在为此积累经验),2×10e6(似乎太低,这套方案作者是架起式一皿养到第12天的,所以我个人觉得看你在哪天收细胞做下游实验,如果只养到第6天或者第8天,多点应该也行吧?)白细胞种100mm细菌培养皿(注意是细菌培养皿,说悬浮细胞还是用细菌皿好,还说抑制细胞贴壁,让更多祖细胞向树突细胞分化而不是巨噬细胞),这一天记为第0天
    4.第3天加等体积(10ml)BMDC培养基
    配方:每50ml含:1640基础培养基45ml, 5ml灭活胎牛血清,50ul 100×的beta巯基乙醇(一直不知道它的作用,请高手跳出来作答谢谢啊),500ul 100×的谷氨酸盐(谷氨酰胺?我现在用Gibco的Glutamax,说不会降解产生氨),1ug rmGM-CSF(Chemicon和PPT的都用过,现在用PPT,还行好像)
    5.第6天,第8天半量换液,离心设置为300g,5min(不知道够不够,肯定有损失)
    6.第10天300g,5min收集悬浮细胞转到细胞培养皿(巨噬细胞多贴点壁),同时培养基成分里rmGM-CSF含量至少减半(好像说怕继续分化成非树突吧,文献看了有一段时间记得不那么清楚了惭愧啊,其实文献仅供参考,也不一定对,关键还是自己的实践)
    7.第11天加LPS刺激其成熟,普遍认为(也可能是我自己认为),第6天或第8天收不成熟DC会比较多,看实验需要,建议想要不成熟DC的朋友请在这两天收网)
    我一般做到第5步就上流式,也就是6到8天的BMDC, CD11c表达波动在50-80%,偶尔做CD86,成熟标志吧?15%左右。具体流式结果和光镜形态照片过几天(或几周)发上来大家一起探讨。MHC2 我没有做(技术员说实验室流式机器做APC的有关部件有故障,我的MHC2抗体正好带APC)。还发现用PE标记和FITC标记的CD11c流式抗体检测 CD11c表达发现阳性细胞数(还是表达量)相差1倍?(同一批细胞分两管,分开操作,抗体剂量不同,都过量了,都洗了两遍,一个公司的抗体,25%和 50%)
    最近有个造血生理的老师说这个方案她们是用来养单核细胞和粒细胞(我已经不确定了,得再问问她)的,对我打击很大Angry。说聚集体包括粒细胞、巨噬细胞(还有什么不记得了,得再问问她)。她建议我流式检测加个阴性指标,我觉得很有道理。我是不是检测的指标太少了?发现国外的也有少有多,但没有我这么少的。
    我养出来的BMDC目前还从未做过功能实验(MLR和CTL)。会陆续搞起,到时候上来求助大家。