• PCR和RT-PCR基础
  • 点击数:  发表日期:2007-12-29
  • 聚合酶链式反应(PCR)过程利用模板变性,引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程,因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般,经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分。
    Template: 10^4-10^6 copies of DNA template
    Primer 1: 0.1-0.5µM
    Primer 2: 0.1-0.5µM
    10X Reaction buffer
    Magnesium(1.0-3.0mM)
    dNTP mix(200 mM each dNTP)
    Thermostable DNA polymerase: 1-4 units/100 ml reaction
    模板可以为纯化的基因组或质粒DNA;由RNA转化得到的cDNA;或未经纯化的粗制生物样品,如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增,但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液,三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点(Tm),忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。