• 细胞的冻存、复苏与运送!
  • 点击数:  发表日期:2007-12-27
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    细胞的冻存

     细胞冻存液一般可有如下组成:

      A 含有血清的冻存液:加入10%20%(v/v)血清和5%10%(v/v)DMSO的培养基;

      B 无血清冻存液:细胞条件无血清培养基与含9-10%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基11混匀。

      细胞冻存过程一般为:

        1)  消化贴壁细胞或收集悬浮细胞,将细胞悬液收集至离心管中;

        2) 1000rpm离心510分钟,弃上清液;

        3)  用一定量冻存液将细胞重悬,计数,调整细胞密度至106107/ml左右;

        4)  将细胞悬液分装至2ml冻存管中,每管11.5ml

        5)  将冻存管口封,贴上标签,做好记录;

        6)  按下列程序降温: 412小时)2012小时)801618小时或隔夜)液氮(LN2)。

    【冻存注意事项】:

          (1) 细胞应在生长良好、致密度约为8090%、活力较高(90%以上)的状态下冻存;

          (2) 冻存前应检测细胞是否仍具其特有性质,例如杂交瘤细胞应在冻存前12日检测产生 抗体的能力;

          (3) 所用DMSO应为试剂级等级,以5~10ml小体积无菌分装,4避光保存,勿多次解冻;

          (4) 细胞的冻存浓度:

      正常人类成纤维细胞(normal human fibroblast):13×106 cells/ml

      贴壁肿瘤细胞(adherent tumor lines):57×106 cells/ml,依细胞种类而异;

      杂交瘤细胞(hybridoma):13×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去;

      其它悬浮细胞(other suspensions):510×106cells/ml

    细胞的复苏

      1) 从液氮罐中取出冻存管,立即放入37水浴内,轻晃冻存管使液体尽快融化,通常应在1分钟内融化;

      2) 75%的酒精棉球擦拭冻存管及管盖,将解冻的细胞悬液移至培养瓶(皿)培养或灭菌离心管内离心弃上清去除DMSO后再培养;细胞解冻后是否立即去除冷冻保护剂(DMSO或甘油),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂,无血清培养基冻存的细胞一般解冻后需立即去除冷冻保护剂。

        若要立即去除,可将解冻的细胞悬浮液加入含510ml培养基的离心管内,离心(8001000 rpm, 5 分钟),弃去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,置培养箱培养;

        若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后次日更换培养基。

    细胞的运送

      1) 冷冻储存运送

      指利用特殊容器内盛液氮或干冰保存运送细胞,效果较好,缺点是比较麻烦,不宜长时间运输,成本较高。

      2)充液法

      一般选择生长良好的细胞,以汇合1/31/2为宜,去掉原培养液,补充新培养液至瓶颈部,保留微量空气,拧紧瓶盖,并用胶带密封,放在用棉花等做防震防压处理的运送盒内。

          (1)  运输时间若需45天,一般放在贴身口袋即可,到达目的地后倒出多余的培养液,只需保留维持细胞生长所需的培养液置37培养,次日传代;

          (2)  若仅需数小时运输路程,可将培养瓶的细胞附着面朝上,或把培养液全部倒掉放在贴身口袋运送。