• 外周血单个核细胞的分离
  • 点击数:  发表日期:2006-5-29
  • 外周血单个核细胞的分离
    外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞,其体积、形态和密度与其他细胞不同,红细胞和多核白细胞密度较大,为1.090左右,而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090,血小板为1.030~1.035。为此利用一种密度介于1.075~1.092之间而近于等渗的溶液(分层液)做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有ficoll和percoll两种。
    (一)ficoll分层液法
    主要用于分离外周血中的单个核细胞,是一种单次密度梯度离心分离法。聚蔗糖-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液,其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖(商品名为ficoll),分子量为40kd,具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的ficoll溶液粘性高,易使细胞聚集,故通常使用60g/l的低浓度溶液,密度为1.020,添加比重为1.200的泛影葡胺(urografin)以增加密度。国外常用商品isopaque或hypaque,故又称ficoll-hypaque分层液,将适量340g/l泛影葡胺加入ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳,因为人的红细胞密度为1.093,粒细胞密度为1.092,单个核细胞在1.076~1.090之间。而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同,如小鼠为1.088,马为1.090。分离时先将分层液置试管底层,然后将肝素化全血以hanks液或pbs液作适当稀释后,轻轻叠加在分层液上面,使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后,离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带(图20-1)。红细胞和粒细胞密度大于分层液,同时因红细胞遇到ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中,唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中,呈白膜状,吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95%,淋巴细胞约占90%~95%,细胞获得率可达80%以上,其高低与室温有关,超过25℃时会影响细胞获得率。

    图20-1 ficoll分层液离心后外周血细胞示意图

    (二)percoll分层液法

    这是一种连续密度梯度离心分离法。percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(pvp)处理的硅胶颗粒,对细胞无毒性。利用percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理,将密度不等的细胞分离纯化。用percoll原液(密度1.135)与约等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合,高速离心后,使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度,再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上,低速离心后,便得四个细胞层。表层为死细胞残片和血小板,底层为粒细胞和红细胞,中间有两层,上层富含单个核细胞(75%),下层富含淋巴细胞(98%)(图20-2)。该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各较好的方法,但操作流程较长,手续较多。

    图20-2 连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图