• 基因组DNA及RNA的提取
  • 点击数:  发表日期:2006-5-29
  • 第一部分:基因组DNA 的提取及常见的问题
    第二部分: RNA的提取及常见的问题
    基因组DNA的用途
    DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象.为了进行测序,杂交和基因的表达,获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提.
    基因组DNA提取的原则
    保证提取的DNA具有一定的长度
    纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质
    排除有机溶剂和金属离子的污染
    蛋白质,多糖,脂类等降低到最低程度
    排除其他核酸分子的污染
    基因组DNA- CTAB法
    CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
    CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.
    在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.
    注:CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的
    植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃.
    基因组DNA- CTAB法
    CTAB提取缓冲液的经典配方
    Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
    EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
    NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;
    CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
    β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除
    基因组DNA- CTAB法
    CTAB提取缓冲液的改进配方
    PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.
    基因组DNA-其它方法
    物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法
    化学方式:异硫氰酸胍法,碱裂解法
    生物方式:酶法
    根据细胞裂解方式的不同有:
    基因组DNA-其它方法
    吸附材料结合法:
    根据核酸分离纯化方式的不同有:
    硅质材料

    阴离子交换树脂
    磁珠
    高盐低pH值结合核酸,低盐高pH值洗脱.
    快捷高效.
    低盐高pH值结合核酸,高盐低pH值洗脱.
    适用于纯度要求高的实验.
    磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物,从而达到分离目的.
    基因组DNA-其它方法
    浓盐法:


    有机溶剂抽提法:


    密度梯度离心法:

    利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离
    有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用
    利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
    DNA提取的基本步骤
    I.材料准备
    II.破碎细胞或包膜-内容物释放
    III.核酸分离,纯化
    IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质
    _
    V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
    材料准备和裂解
    最好使用新鲜材料,植物组织应尽量选取不含油脂,蜡质和真菌感染的部位,保证材料基因组的单一.低温保存的样品材料不要反复冻融
    提取血液基因组DNA时,要选择有核细胞(白细胞);组培细胞培养时间不能过长,否则会造成DNA降解;含病毒的液体材料DNA含量较少,提取前先富集
    基因组DNA的提取
    细胞裂解
    材料应适量,过多会影响裂解,导致DNA量少,纯度低
    针对不同材料,选择适当的裂解预处理方式:
    植物材料--液氮研磨,干种子可以在室温研磨或用粉碎
    动物组织--匀浆或液氮研磨
    组培细胞--无需预处理
    细菌--溶菌酶破壁
    酵母--破壁酶或玻璃珠
    需要用蛋白酶K高温温浴时,定时轻柔振荡
    基因组DNA的提取
    核酸分离,纯化
    采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提供相应的缓冲体系
    采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔
    离心分离两相时,应保证一定的转速和时间
    针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法
    基因组DNA的提取
    核酸分离,纯化
    蛋白质的去除:
    酚/氯仿抽提
    使用变性剂变性(SDS,异硫氰酸胍等)
    高盐洗涤
    蛋白酶处理
    核酸分离,纯化
    多糖的去除:
    高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高盐可溶解多糖.
    用多糖水解酶将多糖降解.
    在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 .
    用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ,冰浴20min.
    核酸分离,纯化
    多酚的去除:
    在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇,抗坏血酸,半胱氨酸,二硫苏糖醇等
    加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合
    盐离子的去除:
    70%的乙醇洗涤
    核酸吸附,沉淀和溶解
    使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA的目的
    另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA
    吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等
    若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
    TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase
    pH值为8.0,可防止DNA发生酸解
    基因组DNA的提取
    基因组DNA的检测
    提取的基因组DNA片
    段在20kb-30kb之间
    高质量的基因组DNA
    带型 单一无拖尾现象
    DNA浓度及纯度的检测
    (A260=1 约 50 μg/ mL 双链DNA; A260/280 约为1.8 )

    基因组DNA提取常见问题
    DNA中含有蛋白,多糖,多酚类杂质
    DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应
    DNA中残留有金属离子
    有RNA的存留
    原因


    重新纯化DNA,过吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等杂质
    重新沉淀DNA,让酒精充分挥发
    增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)
    加入RNase降解RNA
    问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应.
    DNA提取常见问题
    材料不新鲜或反复冻融
    未很好抑制内源核酸酶的活性
    提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断
    外源核酸酶污染
    反复冻融
    原因


    尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融
    液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液
    在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔
    所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌
    将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融
    问题二:DNA降解.
    DNA提取常见问题
    实验材料不佳或量少
    破壁或裂解不充分
    吸附或沉淀不完全
    洗涤时DNA丢失
    原因


    尽量选用新鲜(幼嫩)的材料
    动植物要匀浆研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁.高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量).
    增加吸附的时间,或低温沉淀
    小心操作
    问题三:DNA提取量少.
    内 容
    第一部分:基因组DNA 的提取
    及常见的问题
    第二部分:RNA的提取及常见的
    问题
    分离提纯RNA 的目的
    分析不同发育时期基因的表达状况
    获得新基因
    研究基因的拼接
    分析相应的蛋白产物
    RNA的不稳定性
    由于核糖残基的2'和3'位置带有羟基,RNA易于被RNA酶切割水解
    RNA酶含量丰富,加热后仍能够正确折叠恢复活性,不易失活
    提取RNA的注意事项
    预防RNase污染,应注意以下几方面:
    经常更换新手套.因为皮肤和实验室用品上可能有RNase,会导致RNase污染.
    使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染.
    应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿.玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase.
    常用RNA酶抑制剂
    焦磷酸二乙酯(DEPC): 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 .
    异硫氰酸胍:目前是最有效的RNA酶抑制剂,裂解组织的同时也使RNA酶失活.既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用.
    氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性.
    RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白.RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活.
    其它:SDS,尿素,硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用.
    RNA提取的步骤
    材料的裂解
    杂质的去除
    RNA的吸附或沉淀
    异硫氰酸胍,亚硫氢胍,巯基乙醇,N-月桂肌氨酸 等.使细胞及核蛋白复合物变性,释放RNA,有效抑制核酸酶.
    苯酚,氯仿,异戊醇抽提去除杂物,使DNA及蛋白沉淀到有机相.
    硅质材料的吸附
    或用异丙醇沉淀浓缩RNA.
    经DEPC 处理的水溶解RNA
    材料准备及裂解
    尽量使用新鲜材料,植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位,现取现提.
    组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清,消化系统的组织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理.
    对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻,或投入专门的RNA样品储存液中保存.
    液氮研磨时不要使液氮挥发净,随时补充;加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆.
    RNA的提取
    杂质的抽提
    采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀
    离心分离两相时,应保证一定的转速和时间,使蛋白质,多糖和DNA分布到中间层和有机相中,RNA留在水相中
    对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层,可以再次用有机溶剂抽提
    RNA的提取
    RNA的沉淀和溶解
    含RNA的水相过吸附柱,通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质
    或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集沉淀,70%乙醇洗涤,晾干
    用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA
    样品收集后或需长期保存时应置于-70℃ 或加入RNase抑制剂,分装使用
    RNA的提取
    RNA的检测
    电泳槽系统的处理
    乙二醛化琼脂糖凝胶电泳
    含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳
    RNA纯度及浓度的检测
    (A260=1 ,约40 μg/ mL RNA;
    A260/A280 约为1.9-2.1 )
    RNA提取常见问题
    1 抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚的污染
    2 DNA 的污染
    3 离子浓度较高
    原因


    1 保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心;增加有机溶剂抽提的次数,用吸附柱纯化
    2 减少处理样品的量;加入不含RNase的DNase处理;再次纯化
    3 增加漂洗次数
    问题一: RNA样品不纯
    RNA提取常见问题
    1 样品含有杂质杂液
    2 样品过量或样品裂解
    和匀浆不彻底
    3 RNA未有效的吸附沉淀或洗脱
    4 样品RNA含量少
    原因


    1 去除样品中的杂质,离心除净样品中的培养基或储存液
    2 减少样品用量;充分研磨样品,增加裂解液的用量和裂解的时间
    3 延长吸附时间或保证异丙醇沉淀的时间和离心时间;再次洗脱
    4 重复吸附,加入肝糖等有助RNA沉淀的试剂
    问题二: RNA得率低
    RNA提取常见问题
    1 样品不新鲜或样品保存不当,RNA降解
    2 污染了RNase
    3 样品储存不当
    原因


    1 尽量取新鲜的样品;取样后立即放入液氮保存;或放入专门的储存液内;研磨样品及时补充液氮
    2 认真地处理相应的器具和试剂;严格地操作
    3 -70℃ 冻存,分装使用;加入RNase抑制剂
    问题三:RNA容易降解
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