• RT-PCR实验手册---经典推荐
  • 点击数:  发表日期:2006-5-18
  • Rt-PCR实验步骤
    一、实验器具与材料:
    1
    、移液枪:1ml200μl20μl10μl2μl
    2
    、吸头:1ml200μl20μl
    3
    、匀浆管:5ml
    4
    、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个
    5
    EP管:1.5ml0.2ml100μl
    6
    、试剂瓶:260ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)
    1
    125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)
    7
    、量筒:50ml250ml500ml
    8
    、容量瓶:250ml500ml1000ml
    9
    、试管架:5ml1.5ml20μl
    10
    、盐水瓶:250ml500ml2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC
    11
    、铝制饭盒:4
    12
    、塑料小饭盒:1
    13
    、大瓷缸:2
    14
    、锡泊纸:一卷
    15
    、卷纸:2
    16
    、三角烧瓶:带盖,稍大
    二、实验器具的处理与准备
    1
    、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)
    先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)
    2
    、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)
    3
    、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC
    三、试剂配制:
    1
    DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
    2
    75%乙醇:用无水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)
    3
    、异丙醇:放入棕色瓶中
    4
    、氯仿:放入棕色瓶中
    5
    、琼脂糖
    四、几种缓冲液的配制:
    1
    、电泳缓冲液:
    Tris   54g 
    硼酸  27.5g
    0.5M EDTA  20ml
    pH8.0
    蒸溜水  1000ml
    5×TBE  (贮存液)
    再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液+450ml--→500ml工作缓冲液
    2
    、上样缓冲液:
    0.25%
    溴酚蓝
    0.25%
    二甲苯青FF
    30%
    甘油
    缓冲液,4℃保存
    五、琼脂糖凝胶的配制:
    1
    1.0%
    1.0g
    琼脂糖+100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。
    2
    1.5%:
    同上,将琼脂糖的量改为1.5g
    六、需购置的Rt-PCR材料:
    Taq酶(含MgCl2  Buffer  200u  
    dNTP: 1

    oligo(dT)15: 1 OD        
    M-MLV: 1
              
    RNasin: 1
          
    -- -20℃
    DEPC   5g 
    Trizol    100ml/1
        
    -- 4℃
    Marker: 10μg    0.2μg/ml  

    1543.  994.   697.   515.  377.   231
    七、引物合成
    1
    、内参照:
    GAPDH
    正义:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′
    反义:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′
    β-actin
    正义:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
    反义:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′
    2
    par-4:
    正义:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
    反义:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
    3
    、退火温度计算
    2
    A+T+4G+C
    正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃
    4
    、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好
    5、引物稀释:
    DEPC水量为(μl
    = ? nmol / OD ×
    管上所标OD×100
    是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
    八、PCR产物电泳
    先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。
    九、几个注意点:
    1
    、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?
    2
    Rt时,先打开PCR预热30分钟。
    3
    RNA抽提前,打开离心机预冷。
    TRIzol
    法抽提总RNA
    细胞1×107
    组织100mg

    1mlTRIzol
    细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
    匀浆(要彻底,后转至EP管)
    (组织匀浆量>100mg时分装1ml/EP管)
    颠倒混匀10下,室温5分钟

    加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5
    颠倒混匀10下,室温5分钟
    4℃
    ,离心12000g15分钟
    转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中
    加等体积异丙醇(约400μl),混匀室温10分钟
    4℃
    ,离心12000g10分钟
    弃上清
    加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1ml
    4℃
    离心7500g5分钟
    弃上清,空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)
    溶于DEPC水中至20μl10μl-20μl
    (可在55-60℃水中,<10分钟助溶)
    注:
    1
    RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中,否则DEPC溶解
    2
    、细胞组织加TRIzol匀浆后,可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上)
    3
    RNA75%乙醇中,2-8℃至少可保存一周,-20℃至少可保存一年

    两步法RT-PCR
    (第一步:逆转录反应)
    试剂                浓度                     体积             终浓度
    RNA                                      23μl(11.5μl)
    Oligo(dT)15   0.05μg/μl           4μl(2μl)         0.005μg/μl  

    (稀释10倍后用)
    混匀,离心,70℃ 5min
    立即冰水浴,稍离心
    试剂                  浓度          体积             终浓度
    M-MLV Buffer        5×           8μl  (4μl)            1×
    dNTP                  10mM        2μl  (1μl)        0.5mM
    RNasin              40U/μl        1μl  (0.5μl)        20μ
    M-MLV              200U/μl        2μl  (1μl)        200U
    总体积40μl20μl

    混匀,离心,42℃ 60min

    95℃ 10min
    (破坏MLV

    4℃
    保存
    两步法RT-PCR
    (第二步:PCR反应)
    总体积20μl(50μl)
    试剂                      浓度             体积               终浓度
    Taq Buffer          10×              2μl    (5μl_)        1×
    MgCl2               25mM          1.2μl   (3μl)        1.5mM
    dNTP               10mM            0.2μl   (0.5μl)        <200uM
    上游引物        10pmol/μl        0.3μl   (1μl)        10pmol
    下游引物        10pmol/μl        0.3μl   (1μl)        10pmol
    cDNA
    模板               X  (?)         (1-10μl)        
    DEPC
                                   20μl-4.3μl-X        
    Taq
                  2.5U/μl        0.3μl   (1μl)        2.5U/μl

    混匀
    97℃
    5分钟

    立即冰水浴

    混匀

    95℃          5
           预变性
    94℃        30
           变性
    X℃          40
           退火
    72℃        30
           延伸
    72℃         7
           终末延伸
    28-36
    循环,4℃保温               
    三、电泳:
    1-10μl PCR产物+溴芬兰(1-2.5μl)混匀,加样,电泳。
    注意:Taq酶、M-MLVRnasin-20℃保存,操作时置于冰上。DNTP勿反复冻融.