• 蛋白含量测定方法- Bradford法(考马斯亮蓝法)
  • 点击数:  发表日期:2012-8-7
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    蛋白含量测定方法- Bradford法(考马斯亮蓝法)
     
    原理:
     这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件 下, 可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。反应化合物在4 65-595nm处有最大的光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
    试剂:
    (1)标准蛋白质溶液,牛血清清蛋白(BSA),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
    (2)考马斯亮兰G―250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G―250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用水稀释至1升。
    实验方法:
    (1)取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G―250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
    (2)加完试剂2~5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595,空白对照为第1号试管,即0.1mlH2O加5.0mlG―250试剂。
    注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
    (3)用标准蛋白质量(mg)为横座标,用吸光度值A595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线。由此标准曲线,根据测出的未知样品的A595值,即可查出未知样品的蛋白质含量。
    0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
    特点:
    (1)灵敏度高,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。
    (2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5min左右。由于染料与蛋白质结合的过程大约只要2min即可完成,其颜色可以在1h内保持稳定,且在5min~20min之间,颜色的稳定性最好,因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
    (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子,Tris缓冲液,蔗糖,甘油,巯基乙醇,EDTA等均不干扰此测定法。