• 抗原、抗体酶标记技术
  • 点击数:  发表日期:2012-8-1



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    抗原、抗体酶标记技术
     
    酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体,酶标记的抗原或抗体称为结合物(conjugate)。抗原由于化学结构不同,可用不同的方法与酶结合,如为蛋白质抗原,基本上可参考抗体酶标记的方法。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体,作为抗体标记的酶常用的有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP),不同的酶标记方法也不相同。
    1、辣根过氧化物酶(HRP)标记
    辣根过氧化物酶(horseradish peroxidaseHRP)广泛分布于植物中,因辣根中含量最高而得名,由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉(辅基)构成一种糖蛋白(含糖18%)。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基,加入抗体IgG后该醛基与 IgG氨基结合,形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合,在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了,用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
    标记步骤:
    (1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
    (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。
    (3) 将上述溶液装入透析袋中,对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜。
    (4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立
    即加入10mg IgG(抗体,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小
    时。
    (5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。
    (6) 将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4 PBS透析,4℃过夜。
    (7) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。
    (8) 3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
    (9) 将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。
     
    2、碱性磷酸酶AP)标记
    碱性磷酸酶(alkaline phosphataseAP),是小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶,由多个同功酶组成。常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、β-甘油磷酸钠。、碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体,常用戊二醛一步法,戊二醛是一种双功能团试剂,可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法(如连接AP),将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合,经透析除去标记物中剩余的戊二醛,制得酶标抗体。也可用二步法(如连接HRP)。戊二醛一步法操作简便、有效,而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格,大小也不一,影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二步法,即先将HRP与戊二醛作用,透析除去戊二醛,在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。