• 细胞培养的污染、判断和排除
  • 点击数:  发表日期:2007-12-27
  • 凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物,都应视为污染,包括细菌、真菌、支原体、病毒、异种培养物和化学物质等。

    细菌污染及判断

      大多数细菌(bacteria)污染可以改变培养液pH,使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察,可见满视野都是点状的细菌颗粒,原来的清晰培养背景变得模糊,大量的细菌甚至可以覆盖细胞。细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡。

      当怀疑培养细胞有细菌污染时,取10ml细胞悬液1000rpm离心5分钟,沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞置培养箱培养。若培养物受细菌污染,2448小时内可以获得阳性结果。联合使用青霉素、链霉素对预防细菌污染有效。

     真菌污染及判断

      真菌(fungus)污染易于发现,一般在培养液中有肉眼可见的白色或浅黄色的漂浮小点,念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间,个体细小,有增多趋势,培养液一般不混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列。培养细胞受真菌污染后,细胞生长变慢,最后由于营养耗尽及毒性作用可使细胞脱落、死亡。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。

    支原体污染及判断

      支原体(mycoplasma)是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物,直径0.22μm左右,无细胞壁,对理化因素比较敏感。受污染的细胞在显微镜下无特殊的外观表现,培养液也不浑浊;部分敏感细胞生长增殖变慢,细胞变圆,脱落。在细胞培养过程中,如在显微镜下发现破碎的细胞有许多,培养物需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时,应怀疑培养物可能受支原体污染。支原体可通过培养法、DNA荧光染色法、聚合酶链式反应、免疫学等方法进行检测。

    病毒污染及判断

      新引入的细胞系、天然产物(如血清)和胰蛋白酶均是潜在的病毒污染来源。感染了病毒的宿主细胞形态学上不一定有显著的特异性的改变,应用电子显微镜观察或进行免疫学染色可判断细胞是否被病毒污染。

    其它污染

      由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,操作不当,往往会发生细胞交叉污染。因此尽量不要同时操作两种或两种以上细胞株。

      非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

    污染的排除

      一般的原则是应将污染的细胞弃去,而不要试图去除污染,非常重要的细胞株才考虑去除污染,但在任何情况下,污染都很难完全被消除。

      1)细菌污染的排除:可使用大剂量抗生素冲击法,向污染的细胞培养液中加入大剂量的抗革兰氏阳性和阴性细菌的抗生素,一般采用510倍于常用量进行用药,加入高浓度抗生素后作用2448小时,再换入常规的培养液,有时可以奏效。

      2)支原体的排除:卡那霉素、庆大霉素、支原体去除因子(MRA)、卷须霉素及BM-Cycline等对抗支原体是有活性的,可使用它们抑制或消除支原体。

    7-1 常用抗生素及推荐用量(熊世纲等 1997

    抗生素

    抗菌谱

    常用浓度

    细菌

    真菌

    支原体

    青霉素

    G+

     

     

    100IU/ml

    链霉素

    G-

     

     

    100μg/ml

    庆大霉素

    G+ /G-

     

    +

    200μg/ml

    四环素

    G+ /G-

     

    +

    10μg/ml

    卡那霉素

    G+ /G-

     

    +

    50μg/ml

    两性霉素

     

    +

     

    2μg/ml

    制霉菌素

     

    +

     

    25μg/ml